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“作為一個大規(guī)模、高水平的科研平臺，浙大具有很大的吸引力。回來以后，我所在的物理學(xué)院給到了大力支持，讓我可以安心地作科研。By the way，我在陜西長大，但祖籍是在紹興。當(dāng)時，由于戰(zhàn)亂導(dǎo)致祖輩不得不背井離鄉(xiāng)逃難到西部。而今我回到浙大、回到家鄉(xiāng)，冥冥之中也與浙大西遷精神互相契合?！闭憬髮W(xué)物理學(xué)院百人計劃研究員張德龍說。

圖 | 張德龍（來源：張德龍）

2019 年，在美國讀完博士并完成博后研究之后，張德龍回國加入浙江大學(xué)，主要研究方向是分子光譜成像與交叉前沿技術(shù)。

Z近，他和團隊開發(fā)出一項基于光熱弛豫定位的超分辨成像技術(shù)（PEARL，photothermal relaxation localization）。在生物、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域，這些技術(shù)可以發(fā)揮傳統(tǒng)熒光超分辨技術(shù)所無法替代的無標記定位優(yōu)勢，具備廣泛的應(yīng)用前景。

PEARL：兼容現(xiàn)有熒光技術(shù)，并能追蹤特定蛋白

簡單來說，張德龍?zhí)岢隽艘环N新型顯微鏡技術(shù)，可以通過光熱弛豫實現(xiàn)非熒光分子的超分辨率成像。它擺脫了傳統(tǒng)超分辨成像技術(shù)對于熒光標記的依賴，可以直接進行超分辨成像。

近年來，超分辨技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一項熱門技術(shù)。2014 年，憑借在超分辨技術(shù)方面的貢獻，美國應(yīng)用物理學(xué)家埃里克·白茲格（Eric Betzig）、德國物理學(xué)家史蒂芬·赫爾（Stefan W. Hell）、以及美國化學(xué)家威廉·默爾納（William Esco Moerner）共同獲得諾貝爾化學(xué)獎。

光學(xué)技術(shù)屬于物理范疇，理應(yīng)給他們頒發(fā)物理獎。而諾獎委員會的回答是：以前的分辨率高低取決于透鏡磨的好壞，而今天分辨率的突破是由于人類找到并合成了神奇的熒光分子。

熒光標記技術(shù)在今天已經(jīng)非常成熟，無疑是應(yīng)用Z廣泛的光學(xué)技術(shù)之一。然而，沒有任何技術(shù)是完M的。所謂“成也蕭何敗蕭何”，熒光技術(shù)依舊受限于對熒光分子的依賴，并存在光漂白、標記效率低和選擇性差等問題。

在過去十年中，盡管超分辨率熒光技術(shù)已經(jīng)漸入佳境，但是非熒光超分辨率顯微鏡的發(fā)展仍有很大的空間。長期以來，光學(xué)成像領(lǐng)域的學(xué)者們一直在尋找無標記超分辨技術(shù)，但卻苦于缺乏一個廣泛適用的技術(shù)。

在常見的成像方式中，光熱顯微鏡是一種強大的技術(shù)，具有高靈敏度和通用性，可以兼容電子吸收和振動吸收。

而張德龍此次研發(fā)的基于光熱弛豫定位的超分辨成像技術(shù)，正是通過對光熱效應(yīng)的時間特征進行探測，實現(xiàn)了突破衍射J限的無標記成像。研究中，他和團隊利用位置相關(guān)的光熱耗散，打破了光熱顯微鏡的分辨率J限。

該技術(shù)還具備廣泛的適用性，即針對光學(xué)吸收的分子或結(jié)構(gòu)，基本都可以突破衍射J限進行成像。

相比而言，現(xiàn)有的無標記超分辨技術(shù)，其應(yīng)用大多限制于特定體系或分子結(jié)構(gòu)，并不具有廣泛適用性。

論文中，張德龍課題組還展示了中紅外區(qū)的分子振動光譜，在脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的特征峰的成像能力，也展示了以金納米顆粒為代表的電子吸收光譜在可見光區(qū)的成像能力。

這兩個模式覆蓋了從可見光到中紅外（約 400nm~10000nm）的光譜范圍，都是具有代表性的光譜學(xué)應(yīng)用案例，也充分證明了基于光熱弛豫定位的超分辨成像技術(shù)的廣泛適用性。

同時，以酵母模型為例，該團隊還展示了這項技術(shù)在生物等方面的研究潛力。

（來源：Nature Photonics）

通過紅外吸收特征峰，他們選擇性地對空間聚集的脂肪和蛋白質(zhì)分子進行超分辨成像。在傳統(tǒng)方法里，對脂肪等小分子代謝物的熒光標記往往比較困難，一般是通過特定蛋白間接進行探測，但即便如此也很難做到定量化。

而基于光熱弛豫定位的超分辨成像技術(shù)，可以直接對脂肪進行無標記超分辨成像，能對生物代謝等過程進行前所W有的精確觀測，對于解密生物過程具有不可替代的價值。

此外，這項技術(shù)也能兼容現(xiàn)有的熒光技術(shù)，可以在分子成像基礎(chǔ)上同時進行免疫熒光對于特定蛋白的追蹤。

值得一提的是，在熒光成像中一般超過 3 個同時標記就會比較困難。而分子光譜譜峰的寬度一般很窄，具備同時追蹤多個分子的能力。

此前，就有其他團隊同時進行幾十個不同分子的追蹤 [1], 而張德龍課題組研發(fā)的基于光熱弛豫定位的超分辨成像技術(shù)，也沿襲了這種高通量光譜復(fù)用優(yōu)勢。

從上網(wǎng)時用的“貓”說起

據(jù)介紹，本次工作是在張德龍前期成果的基礎(chǔ)上展開的 [3]，即通過光熱效應(yīng)所衍生的超靈敏探測技術(shù)，來對光學(xué)吸收進行觀測，并將其應(yīng)用于紅外成像，借此突破了傳統(tǒng)紅外成像的局限，實現(xiàn)了三維、亞微米分辨率的活細胞成像。

張德龍表示：“對于 PEARL 這項工作來說，Z開始還是比較偶然的?！边@就不得不提到調(diào)制（modulation）技術(shù)。在工程上，調(diào)制技術(shù)應(yīng)用J為廣泛，從收音機到 5G 通訊都少不了這個技術(shù)。

比如，我們上網(wǎng)時用到的“貓”就是 modem 的俗稱，它是 modulator-demodulator（調(diào)制解調(diào)器）的縮寫。調(diào)制技術(shù)的核心其實很簡單，好比我們開車時會用到閃車燈，從而讓汽車從紛繁復(fù)雜的周圍環(huán)境中“跳”出來。

科研領(lǐng)域也經(jīng)常用到調(diào)制，就是把激發(fā)光在頻率 f 進行“閃爍”（即調(diào)制），然后用探測器在頻率 f 上探測這個“閃爍”（即解調(diào)），借此可以提高信噪比。

張德龍表示：“學(xué)界對于調(diào)制技術(shù)的認知，一直以來也是這樣延續(xù)的，沒有人去探索更多的應(yīng)用潛力。但從來如此就是對的嗎？于是我在回國后，開始了這方面的探索?！?/span>

對于在探索中的發(fā)現(xiàn)，張德龍舉例稱：小時候我們玩的“紅白機”游戲，其中的音樂聲音很奇怪，同樣是一個 C 大調(diào)，但卻遠遠比不上鋼琴的音色。

這是因為合成音樂可以產(chǎn)生純正弦的振動，而鋼琴的琴弦沒法產(chǎn)生純正弦的振動，其中伴隨著很多“不完M”的振動，這在物理上會產(chǎn)生很多倍頻的振動，這一現(xiàn)象一般稱為諧波。而對于這樣的聲音，人耳會感到更加自然。

意識到這一點之后，張德龍和課題組開始觀察諧波頻率上的信號，Z開始他們想把這些信號都加起來，從而更進一步提高信噪比（通過利用這一想法，另一研究組做出了獨立研究成果）。

但是，讓張德龍沒想到的是，諧波頻率上的成像結(jié)果與原圖并非完全一致。這讓他感到非常出乎意料，在好奇心的驅(qū)動之下，便有了這次課題的開端。

正式立項以后，他和團隊以微球系統(tǒng)為準，深入研究了掃描成像分辨率與諧波階次的關(guān)系。得到可重復(fù)的結(jié)果之后，逐步地大膽開展活細胞成像的研究。

期間，他們注意到 PEARL 的物理原理，同樣適用于一般的光熱現(xiàn)象。于是，又開始研究電子吸收的光熱成像，并選擇納米結(jié)構(gòu)這樣一個Z具代表性的材料成像，借此讓 PEARL 分辨率的提升得到了驗證。

（來源：Nature Photonics）

然而，張德龍卻用“一波三折，命途多舛”來形容整個研究過程。他說：“疫情的影響自不用說，期間我們的實驗中斷了不止一次。并且在實驗中，Z核心的一個激光器在安裝運行一周之后，有一個控溫模塊毫無征兆地突然壞掉了，而且要返廠維修?！?/span>

在此情況下，他們使用這臺“半壞”的激光器，終于趕在返修提貨的前一周完成了實驗。

另外，有一部分實驗要在紅外飛秒系統(tǒng)里完成。當(dāng)時激光器的狀況很差，大概每隔三個月就得讓工程師上門維修一次，研究進度也被嚴重掣肘。

而Z為艱苦的是，在做可見光泵浦成像的實驗時，他們手頭沒有光源。后來，張德龍在研究所里上上下下地找，終于借到了閑置的紅光激光和綠光脈沖激光，確保了實驗驗證的完成。

他繼續(xù)說道：“很有緣分的是，本文**作者傅鵬程是加入我們組的**個博士生。鵬程也從做實驗時衣服被激光燒出洞洞的‘小白’，成長為可以獨立操作系統(tǒng)的科研人員。有一天他神情凝重地告訴我，他把我們十幾萬的掃描平臺搞壞了。后來認真排查原因，發(fā)現(xiàn)是新版本驅(qū)動之后，引腳的定義被修改了，原來是虛驚一場。這些大大小小的事情鍛煉了學(xué)生的‘debug’能力，也讓我們造就了一套科研方法學(xué)?！?/span>

Z終，相關(guān)論文以《光熱弛豫定位顯微鏡對非熒光分子的超分辨率成像》（Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy）為題發(fā)在 Nature Photonics 上，傅鵬程是**作者，張德龍擔(dān)任通訊作者 [2]。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature Photonics）

事實上，PEARL 也是近年來的新興前沿方向之一，因此張德龍也將繼續(xù)深入探索。一方面，他們希望可以進一步優(yōu)化系統(tǒng)性能，比如提高采集帶寬和通量、提高分辨率等；另一方面，在應(yīng)用拓展上他們也將進行更多的外部合作，同時會在紅外超分辨成像領(lǐng)域開發(fā)更加新穎的成像技術(shù)。

參考資料：

1.Nature 544, 465–470 (2017)

2.Fu, P., Cao, W., Chen, T.et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat. Photon. (2023). https://doi.org/10.1038/s41566-022-01143-3

3.Science Advances 2, e1600521 (2016)