2023 年 2 月 23 日，北京大學(xué)程和平 - 王愛民團(tuán)隊在 Nature Methods 在線發(fā)表題為《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection》 的文章。文中報道了重量僅為 2.17 克的微型化三光子顯微鏡，首次實(shí)現(xiàn)對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經(jīng)元功能成像，為揭示大腦深部結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)機(jī)制開啟了新的研究范式。

微型化三光子顯微鏡首次實(shí)現(xiàn)自由行為動物非侵入式深腦成像

海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個毫米。由于大腦組織特別是胼胝體，具有對光的高散射光學(xué)特性，所以突破成像深度極限是長期以來困擾神經(jīng)科學(xué)家的一個極大的挑戰(zhàn)。此前的微型化單光子及微型化多光子顯微鏡均無法實(shí)現(xiàn)穿透全皮層直接對海馬區(qū)進(jìn)行無損成像。

由于腦組織是高散射介質(zhì)，來自腦深層的熒光信號達(dá)到表面時已經(jīng)隨機(jī)散射。臺式三光子顯微鏡使用工作距離大于 2mm、數(shù)值孔徑 1.0 的大尺寸物鏡，在滿足深層成像工作距離要求的同時保持足夠的熒光信號收集效率。但在微型探頭中，如果物鏡工作距離為 2mm，使用大數(shù)值孔徑物鏡，探頭重量和體積就比較大，無法滿足自由行為小鼠對于探頭重量和體積的要求。

因此，解決這一問題的關(guān)鍵是在減小物鏡數(shù)值孔徑情況下，保持足夠的熒光收集效率。

此次微型化三光子顯微鏡的研發(fā)將經(jīng)典阿貝聚光鏡結(jié)構(gòu)引入探頭光學(xué)構(gòu)型設(shè)計中，將微型阿貝聚光鏡與簡化的無限遠(yuǎn)物鏡密接以提高散射熒光收集效率，同時在激發(fā)光路引入李斯特物鏡作為管鏡補(bǔ)償簡化物鏡的像差，并通過將阿貝聚光鏡與李斯特管鏡部分復(fù)用，實(shí)現(xiàn)探頭體積的減小。新微型化顯微鏡構(gòu)型在工作距離 1.75mm、數(shù)值孔徑 0.65、物鏡直徑僅 3.4mm 時，實(shí)現(xiàn)了與臺式三光子顯微鏡熒光收集效率相當(dāng)?shù)乃健?/p>

在全球，該微型化三光子顯微鏡首次實(shí)現(xiàn)了自由行為動物非侵入式深腦成像解決方案，可穿透小鼠大腦全皮層和胼胝體，實(shí)現(xiàn)對海馬 CA1 亞區(qū)的直接觀測記錄，避免植入式 Grin Lens 損傷腦組織。神經(jīng)元鈣信號*大成像深度可達(dá) 1.2mm，血管成像深度可達(dá) 1.4mm。同時，微型化三光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)全皮層鈣信號成像僅需幾毫瓦，海馬鈣信號成像僅需 20-50mw，大大低于組織損傷的安全閾值。

嶄露頭角—— 2.2 克微型化雙光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)自由行為小鼠腦成像

在多光子成像領(lǐng)域，這支來自北大的團(tuán)隊已深耕多年。

2017 年，程和平院士領(lǐng)導(dǎo)的北大交叉團(tuán)隊成功研制出**代 2.2 克微型化雙光子顯微鏡 FHIRM-TPM，在全球首次實(shí)現(xiàn)了自由運(yùn)動小鼠單個樹突棘水平神經(jīng)元功能活動的高速、高分辨率實(shí)時成像。該微型化雙光子顯微鏡可實(shí)時記錄自由行為動物的大腦神經(jīng)元和樹突棘活動，支持鈣成像，并可在同一視野長時程反復(fù)成像。

此前，在用臺式雙光子顯微鏡研究活體小鼠腦活動時，需先麻醉小鼠并將其頭部固定。這種情況下，小鼠不能自由運(yùn)動，無法研究如打斗、哺乳及社交行為，懸尾實(shí)驗(yàn)、電擊實(shí)驗(yàn)等研究受限。此外，臺式雙光子顯微鏡不便移動且占用面積較大。

隨著科技的發(fā)展，部分研究人員引入虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)，在小鼠面前放一個顯示器，并將小鼠放在跑步機(jī)上，在跑的過程中投放虛擬場景并觀察小鼠腦活動。但這種方法也飽受爭議。其一，在虛擬現(xiàn)實(shí)和現(xiàn)實(shí)情景中，小鼠大腦神經(jīng)元的反應(yīng)情況不一定完全相同；其二，動物在頭部固定的情況下會有情緒上的壓力，還可能出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)。

據(jù)吳潤龍介紹，北大團(tuán)隊的微型化雙光子顯微鏡主要有以下幾方面突破，一是飛秒激光的柔性傳輸，普通的光纖在傳輸飛秒激光時具有很強(qiáng)的色散和非線性效應(yīng)，導(dǎo)致雙光子激發(fā)效率變低，北大團(tuán)隊開發(fā)了一種新型空心光子晶體光纖，可以無失真地傳輸 920nm 飛秒激光，從而高效地進(jìn)行綠光熒光蛋白雙光子激發(fā)。

二是成像物鏡，傳統(tǒng)物鏡直徑在 20mm 左右，重量比一般小鼠還重，北大團(tuán)隊開發(fā)的微型物鏡直徑為 3.5mm、長 10mm，內(nèi)部有上十個鏡片組合，分辨率依然可以達(dá)到衍射極限；三是高速成像，為了減少運(yùn)動帶來的偽影，需要快速地進(jìn)行成像，北大團(tuán)隊通過高速 MEMS 掃描振鏡，在微型化上實(shí)現(xiàn)了視頻級的成像速度。*后，各項(xiàng)技術(shù)的高質(zhì)量集成，構(gòu)成了 2.2g 的高時空分辨微型化雙光子探頭。

全球范圍內(nèi)，這款 " 戴著跑 " 的微型化雙光子顯微鏡**次實(shí)現(xiàn)了自由行為動物的清晰穩(wěn)定成像，可用于在動物覓食、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后，長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化，從而獲取小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動的動態(tài)圖像。

諾貝爾生物學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者愛德華 · 莫索爾（Edvard.I. Moser）博士曾稱這款顯微鏡是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個 " 革命性 " 新工具。

持續(xù)深耕——拓寬腦科學(xué)研究的邊界，應(yīng)用場景不斷升級

2021 年，這支北大團(tuán)隊推出了第二代微型化雙光子顯微鏡 FHIRM-TPM 2.0，將成像視野擴(kuò)大了 7.8 倍，成像的橫向分辨率、軸向分辨率比**代顯微鏡高約 1.5 倍，同時具備獲取大腦皮層上千個神經(jīng)元功能信號的三維成像能力。

除在核心性能上實(shí)現(xiàn)升級外，新一代微型化雙光子顯微鏡采用整機(jī)一體化設(shè)計，滿足更小空間實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。同時具有較強(qiáng)的兼容性，內(nèi)置激光適配模塊，可匹配市面上所有品牌的飛秒激光器，以更強(qiáng)大的成像性能、更廣泛的適配性能及更便捷的操作性能為成像技術(shù)的發(fā)展帶來新的活力。

基于微型化雙光子顯微鏡，北大團(tuán)隊與浙江大學(xué)的胡海嵐團(tuán)隊、中科院孫衍剛團(tuán)隊等開展合作。如孫衍剛團(tuán)隊在研究癢覺感知神經(jīng)機(jī)制，由于癢覺出現(xiàn)過程非?？?、神經(jīng)元發(fā)放也很快，而且不同比例的神經(jīng)元在癢覺感知的不同階段出現(xiàn)，這要求成像設(shè)備不僅需要快速記錄單個神經(jīng)元，還需具備高空間分辨率以區(qū)分兩類神經(jīng)元。

此前，大腦皮層對癢覺感知的編碼機(jī)制的研究多在麻醉動物中進(jìn)行，這種情況下動物無法通過抓撓行為報告對癢覺的感知。通過微型化雙光子顯微鏡，孫衍剛團(tuán)隊在小鼠自由活動時實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分辨率的鈣成像，為癢覺機(jī)制的研究提供了新的方案。

在應(yīng)用場景上，北大團(tuán)隊也一直在突破極限。2022 年，團(tuán)隊攻克了航天極端環(huán)境機(jī)體應(yīng)激與防護(hù)等多項(xiàng)技術(shù)難題，研制出空間站雙光子顯微鏡。據(jù)程和平院士此前的介紹：" 在軌實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備對可靠性、體積、重量、抗沖擊和振動性能等有著更苛刻的要求，要想研制出能夠進(jìn)入太空的雙光子顯微鏡并非易事。"

近日，神舟十五號的航天員使用其空間站雙光子顯微鏡，成功獲取皮膚表皮及真皮淺層的三維圖像，可用于航天員的在軌健康監(jiān)測。

科研成果產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵一步，

搭建可控的供應(yīng)鏈

王愛民提出，由于綜合技術(shù)等原因，目前全球范圍內(nèi)為數(shù)不多的課題組在研究微型化雙光子顯微鏡，只有更多參與者加入，才能更快地推廣技術(shù)、做大產(chǎn)業(yè)。

創(chuàng)新技術(shù)的大規(guī)模推廣離不開產(chǎn)業(yè)化。以中國科學(xué)院院士及北京大學(xué)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)和生理學(xué)等多學(xué)科專家為背景成立的北京超維景生物科技有限公司（以下簡稱 " 超維景 "）實(shí)現(xiàn)了科研成果的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。目前，超維景在北京、南京兩地的團(tuán)隊人數(shù)已超 100 人，吸引了在生產(chǎn)、注冊、市場推廣等領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)豐富的產(chǎn)業(yè)人士加入。

從科研項(xiàng)目走向產(chǎn)業(yè)化，除了企業(yè)自身的技術(shù)積累、差異化產(chǎn)品創(chuàng)新、工藝流程控制外，可控的供應(yīng)鏈?zhǔn)顷P(guān)鍵因素之一。

據(jù)王愛民回憶，曾經(jīng)我們做的**個 " 商業(yè)化試水 " 的項(xiàng)目是雙光子光片顯微鏡，其中的一個核心部件變焦透鏡只有一家美國公司可以提供，在我們做科研、小范圍應(yīng)用時，可以正常買到，但當(dāng)我們決定產(chǎn)業(yè)化后，這家美國公司便不提供了，這也就直接導(dǎo)致項(xiàng)目 " 夭折 "。

在此后的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中，超維景選擇 " 自力更生 " 加 " 內(nèi)外合力 " 的模式。一是自主研發(fā)逐步實(shí)現(xiàn)雙光子顯微鏡產(chǎn)品核心零部件國產(chǎn)化；二是聯(lián)合國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的參與者，由他們根據(jù)需求開發(fā)新技術(shù)。

目前，超維景已建立起可控的產(chǎn)業(yè)鏈，如飛秒激光器、空心光纖、微型化物鏡等都已實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，為公司后續(xù)醫(yī)療產(chǎn)品線的發(fā)展打下堅實(shí)基礎(chǔ)，不僅在研發(fā)、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)自主可控，還可大大降低生產(chǎn)成本。

兩條腿走路，

邁出科研設(shè)備的 " 舒適區(qū) "

王愛民提出：" 中國腦科學(xué)起步較晚，市場不足美國的十分之一，但是 2021 年中國腦計劃正式啟動，預(yù)計 5 年 500 億的投入。" 同時，雙光子顯微成像應(yīng)用于在體病理的研究和應(yīng)用工作在全球也開展近 20 年，雙光子作為活體成像利器應(yīng)用于臨床診斷研究也展示了應(yīng)用潛力。超維景堅持科研設(shè)備、醫(yī)療器械兩條腿走路，力求實(shí)現(xiàn)從動物到人，更大程度地造福人體健康。

手持式皮膚生物細(xì)胞檢測儀是公司的首次 " 試水 "。該產(chǎn)品以微型化雙光子顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)在體、原位、無創(chuàng)、無標(biāo)記的微納米級顯微成像，細(xì)胞、彈性纖維、膠原纖維、代謝信息等清晰可見。

手持式皮膚生物細(xì)胞檢測儀主要有兩大應(yīng)用市場。一是臨床的應(yīng)用，在院內(nèi)進(jìn)行實(shí)時在體的檢測。目前院內(nèi)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是病理檢查，需從人體切下一小塊組織送檢，操作有創(chuàng)且需等待一段時間（一般是 3-5 天）才能得到檢查結(jié)果。而很多情況下臨床需要快速決策、定期監(jiān)測，如黑色素瘤、皮膚癌等定期檢查。通過手持式皮膚生物細(xì)胞檢測儀，醫(yī)生可隨時監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)的變化，觀察患者病情變化，以調(diào)整治療計劃。

二是皮膚功效檢測的應(yīng)用，超維景正在開展皮膚圖譜研究，可用于化妝品、醫(yī)美技術(shù)的評估。據(jù)王愛民介紹，化妝品提到幫助改善肌膚狀態(tài)，但其中并沒有客觀標(biāo)準(zhǔn)，我們可直接基于對皮膚細(xì)胞的觀察，檢測其中的彈性纖維、膠原纖維，推出客觀的皮膚年齡標(biāo)準(zhǔn)，用于評估化妝品的有效性。

在醫(yī)療領(lǐng)域，超維景在開發(fā) 3D 4K 熒光內(nèi)窺鏡，在傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡的基礎(chǔ)上加入細(xì)胞成像功能，使醫(yī)生看到更多信息，進(jìn)一步推動精準(zhǔn)診斷。

王愛民提到：" 新技術(shù)的推廣市場教育非常重要，尤其是在保守謹(jǐn)慎的醫(yī)療市場。我們要先充分理解醫(yī)生的使用習(xí)慣再去設(shè)計產(chǎn)品，創(chuàng)新技術(shù)要變成對醫(yī)生而言真正好用的產(chǎn)品。" 目前，超維景正在跟 301 醫(yī)院合作，開發(fā)一次性內(nèi)窺鏡，用于消化道早癌的篩查、診斷；公司也在與協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科聯(lián)合開展宮頸癌早篩方面的研究。

寫在*后

腦科學(xué)，無疑是近年來醫(yī)療領(lǐng)域*火的命題之一。

人類腦部結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜，包含千億個神經(jīng)元，至今科學(xué)家都仍在探索情緒、感情等發(fā)生機(jī)制。成像技術(shù)是腦科學(xué)研究發(fā)展的關(guān)鍵。從 CT、MRI 到 PET 等成像技術(shù)，都是為做到 " 眼見為實(shí) "。人類不斷追求，在新鮮樣本、甚至是活體上直接進(jìn)行高分辨率成像。多光子顯微成像技術(shù)在成像分辨率、速度、深度等多方面具有較大優(yōu)勢，賦能腦科學(xué)研究。

同時將進(jìn)一步揭示腦疾病發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)檢測治療方法的開發(fā)。如癲癇、帕金森、阿爾茲海默等神經(jīng)系統(tǒng)疾病所帶來的社會負(fù)擔(dān)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，且持續(xù)周期長，缺少有效的治療手段。如果能在疾病機(jī)制上有一些新的發(fā)現(xiàn)，做到早防早治，可極大地減輕社會負(fù)擔(dān)。

再者，成像技術(shù)必將與數(shù)字技術(shù)特別是人工智能技術(shù)緊密結(jié)合，"AI+" 的成像系統(tǒng)將進(jìn)一步提高臨床醫(yī)生的診療水平。

綜合來看，多光子顯微成像技術(shù)擁有 " 科研 + 臨床 " 的廣闊應(yīng)用空間，將成為人類在腦科學(xué)研究海域中的一座燈塔，照亮更多隱秘的角落。

參考文章：

《你為什么會癢？中科院研究揭示癢覺表征和感知的神經(jīng)機(jī)制》——澎湃新聞

《【科技前沿】北京大學(xué)程和平 / 王愛民團(tuán)隊研制成功微型化三光子顯微鏡》——中國生物物理學(xué)會

《多光子顯微成像技術(shù)在腦部疾病研究中的應(yīng)用》——黃燕霞、周非凡、周婷、許皓、林丹櫻、屈軍樂

《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 》——《Nature Methods》

《世界首次！北大研制空間站雙光子顯微鏡獲取航天員皮膚三維圖像》——北京大學(xué)