先來(lái)聊聊目前幾種常見(jiàn)的SRM（超分辨顯微鏡）技術(shù)原理：

一、受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡

STED對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的熒光顯微鏡使用者來(lái)說(shuō)相對(duì)簡(jiǎn)單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個(gè)光源發(fā)射能激發(fā)熒光團(tuán)——熒光標(biāo)簽（研究者們以此來(lái)定位和觀察蛋白）的光，另一個(gè)光源發(fā)出不同波長(zhǎng)的光，用于抑制熒光。這束光是環(huán)形的，并且與**束光有所重疊，因此只有環(huán)形中間區(qū)域的分子會(huì)繼續(xù)發(fā)出熒光。

獲得STED超分辨率圖片并沒(méi)有那么復(fù)雜，用戶需要仔細(xì)調(diào)整參數(shù)，才能得到漂亮的結(jié)果，否則所得圖片和普通confocal沒(méi)有差別。

使用傳統(tǒng)和RESCue受激發(fā)射減損顯微鏡（STED）得到的細(xì)胞核膜上核孔復(fù)合體的圖片。

STED的原理：

顯微鏡透鏡對(duì)光的衍射會(huì)導(dǎo)致來(lái)自單個(gè)點(diǎn)的光出現(xiàn)在較大的區(qū)域，這稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），由于PSF的存在，使得常規(guī)顯微鏡無(wú)法達(dá)到超分辨。

在普通光學(xué)顯微鏡中，成像是通過(guò)將來(lái)自點(diǎn)光源的光線會(huì)聚到像平面上的單個(gè)點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。超出光衍射的限制，防止了射線的精確會(huì)聚，從而導(dǎo)致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的大小，或?qū)ο笤谀硞€(gè)點(diǎn)的三維強(qiáng)度分布。在STED中，應(yīng)用環(huán)形炸彈耗盡型激光器，其零點(diǎn)與激發(fā)激光焦點(diǎn)的*大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑制了來(lái)自零點(diǎn)附近區(qū)域的熒光，導(dǎo)致有效PSF的尺寸減小”。

而受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡通過(guò)限制樣品的熒光區(qū)域（PSF）產(chǎn)生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個(gè)重疊的激光，**個(gè)按照常規(guī)顯微鏡激發(fā)熒光團(tuán)（圖2A）。第二個(gè)激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發(fā)“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強(qiáng)度點(diǎn)非常?。?30 nm）（未激發(fā)）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關(guān)閉”**激光所產(chǎn)生的外圈熒光，從而將樣本激發(fā)的熒光分子范圍縮小到中心圓點(diǎn)處，這有效地降低了PSF，以產(chǎn)生非常小的單分子熒光聚焦區(qū)域，從而獲得高分辨率圖像。

1.單個(gè)小于250 nm的蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像解析，從而導(dǎo)致圖像模糊

2.STED耗盡激光器產(chǎn)生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

3.飽和耗盡在功能上降低了激勵(lì)PSF

4.隨之可以解析單個(gè)蛋白質(zhì)

適用于STED的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體：

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長(zhǎng)的高發(fā)射截面，并有效地實(shí)現(xiàn)高飽和度。這種強(qiáng)烈的照明確保了所有被STED激光“關(guān)閉”的分子都受受激發(fā)射的支配。合適的染料應(yīng)具有低的光漂白性，具有高的量子產(chǎn)率和對(duì)比度，并在目標(biāo)附近具有足夠的標(biāo)記密度。如下列染料標(biāo)記的二抗已被驗(yàn)證在STED中成功使用：

Alexa Fluor 488標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，#115-545-003

與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比，具有發(fā)光亮度更強(qiáng)，靈敏度更高，背景更低的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)其對(duì)pH的穩(wěn)定性更好，發(fā)光 也更持久，因此更適合于拍照。Alexa Fluor熒光熒光染料作為熒光顯微鏡、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)內(nèi)的生物分子、細(xì)胞和組織標(biāo)記物，可應(yīng)用于生物技術(shù)和研 究等眾多領(lǐng)域。

二、隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）

*初所有的熒光標(biāo)簽都是暗的。然后使用激光脈沖來(lái)激活一小部分熒光標(biāo)簽，隨后使用另一束光來(lái)關(guān)閉這些熒光標(biāo)簽。不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，生成一系列部分熒光圖，*后重建成整個(gè)視野的熒光圖。以產(chǎn)生分辨率優(yōu)于常規(guī)方法收集的圖像。

使用超分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學(xué)家首次觀察到了神經(jīng)元軸突的細(xì)胞骨架。

用于單分子定位實(shí)驗(yàn)的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體

用于單分子定位的*佳染料通常非常亮，并產(chǎn)生足夠的光子以可靠地產(chǎn)生緊密的高斯分布。例如艾美捷Jackson 的AlexaFluor?488，AlexaFluor?647和Cy?5，可用于這些類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)。建議用于超分辨顯微鏡的熒光染料偶聯(lián)物。

每種SRM技術(shù)都有各自的探針選擇要求，需要注意的是，SRM領(lǐng)域變化迅速，因此，建議從專(zhuān)業(yè)技術(shù)文獻(xiàn)中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團(tuán)。