激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計(jì)算機(jī)、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化，定量分析，以及實(shí)時(shí)定量測(cè)定等。
 

　　成像原理
 

　　采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，*終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像 ，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，*終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。
 

　　每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔。
 

　　激光共聚焦的工作原理簡(jiǎn)單表達(dá)就是它采用激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計(jì)算機(jī)控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。
 

　　基本結(jié)構(gòu)
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)以及圖像輸出設(shè)備等。
 

　　（1）掃描模塊
 

　　掃描模塊主要由針孔光欄(控制光學(xué)切片的厚度)、分光鏡(按波長(zhǎng)改變光線傳播方向)、發(fā)射熒光分色器(選擇一定波長(zhǎng)范圍的光進(jìn)行檢測(cè))、檢測(cè)器(光電倍增管)組成。熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器，經(jīng)過檢測(cè)針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測(cè)并形成相應(yīng)的共焦圖象，同時(shí)在計(jì)算機(jī)屏幕上可以顯示幾個(gè)并列的單色熒光圖象及其合成圖象。
 

　　（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)
 

　　顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插入光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測(cè)量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點(diǎn)：需與掃描器連接，使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測(cè)器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時(shí)汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)。
 

　　（3）常用激光器
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型：
 

　　半導(dǎo)體激光器：405nm(近紫外譜線)
 

　　氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm(藍(lán)綠光)
 

　　氦氖激光器：543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm (紅光—氦氖紅激光器)
 

　　UV激光器(紫外激光器)：351 nm、364 nm(紫外光)
 

　　（4）輔助設(shè)備
 

　　風(fēng)冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的一定波長(zhǎng)的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應(yīng)的被照射點(diǎn)受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測(cè)孔光欄后，到達(dá)檢測(cè)器，并成像于計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點(diǎn)的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。